Среда 199 с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, гепарин, без консерванта 1:64, (изотоп, СССР) с активностью 10 Кн мл.

Ход реакции:

1. 0,1 мл гепаринизированной крови с содержанием лимфоцитов порядка 5х 105 мм3 вносят в пенициллиновые флаконы с 2 мл среды 199, туда же добавляют 0,1 ФГА I : 64.

2. Смесь инкубируют при 37°С 48 ч, после чего добавляют тимидин из расчета 1 мкКи мл в объеме 0,1 мл и продолжают инкубацию до 72 ч. Параллельно выращивают контрольные культуры без но с тимиднном.

3. После 72-часовой инкубации содержимое флакона взбалтывают и добавляют туда 3%-ную уксусную кислоту объемом порядка 4 - 6 мл для лизиса эритроцитов. Содержимое ресуспендируют и переливают в центрифужные пробирки.

4. Пробирки центрифугируют 3 - 5 мин при 1500 об мин, налосадочную жидкость удаляют, осажденные клетки вновь ресуспендируют в 3%-ной уксусной кислоте и снова центрифугируют, простая каша из пшенички.

5. К осадку добавляют 5 мл холодной 5%-ной трихлоруксусной кислоты - ТХУ и выдерживают пробирки в течение 30 мин при 40° до полного выделения из клеток кнслото растворных фракций.

6. Затем следует центрифугирование при 1500 об мин 3 - 5 мин. После этого надосадочную жидкость сливают, а пробирки оставляют в перевернутом виде на фильтровальной бумаге на 2 - 3 ч до полного высушивания осадка.

7. Выделение ДНК посредством гидролиза в 5%-ной ТХУ (0,5 мл) при 90° в течение 30 - 45 мин; в гндролизат добавляют 1,5 мл абсолютного спирта или метанола, центрифугируют, надосадок переливают в счетные флаконы.

8. В гндролизат добавляют 10 мл сцинтилляционной жидкости. Пробы подсчитывают на сцинтнлляцнонном счетчике, результаты выражают числом импульсов в минуту.



Комментарии

Чтобы оставить комментарий, необходимо войти или зарегистрироваться


Translate to English
Сейчас на сайте посетителей:2