Выделение лимфоцитов.

1. В центрифужную пробирку с 0,2 мл гепарина набирают 5 мл крови обследуемого человека. Кровь отстаивается при комнатной температуре 30 - 45 мин.

2. Надосадочная плазма с лейкоцитарным кольцом (верхний слой осадка) осторожно по стенке наслаивается на 5 мл верографин, пробирку немедленно центрифугируют 30 - 40 мин при 1500 об мин.

После центрифугирования содержимое пробирки четко делится на 4 слоя: сверху вниз плазма, кольцо мононуклеарных клеток, в основном лимфоцитов, верографин с частичной примесью эритроцитов, эритроцитарная масса с примесью гранулоцитов.

3. Кольцо лимфоцитов отсасывают в стерильную центрифужную пробирку с 5 мл охлажденного до +4°С раствора Хэнка.

4. Содержимое пробирки центрифугируют 10 - 15 мин при 1000 об мин, надосадочную жидкость выливают, процедуру повторяют трижды.,

5. К клеточному осадку добавляют 0,8 мл среды 199, клетки ресуспендируют и подсчитывают их число в камере Горяева. В рабочей взвеси должно быть порядка ЫО7 лимфоцитов мм3.

Определение Т-лимфоцитов, швейная 322класс.

1. К 0,1 мл полученной взвеси лимфоцитов добавляют 0,05 мл 2%-ной взвеси бараньих эритроцитов в среде 199. В результате получают смесь клеток в соотношении порядка 1 :40.

2. Смесь инкубируют в течение 5 мин при 37°С, центрифугируют 5 мин при 1000 об мин и помещают в холодильник при 4°С на 1 ч.

3. Осадок осторожно ресуспендируют, добавляют 0,05 мл 1%-ного раствора метиленовой сини, помещают взвесь в камеру Горяева и подсчитывают число лимфоцитов с прикрепленными эритроцитами. Как розеткообразующую (Е-РОК) оценивают клетку, к которой прикрепилось не менее трех эритроцитов. Окуляр 7 или 10, объектив 40. Всего подсчитывают 200 лимфоцитов, розеткообразующих и свободных. В порем таким методом определяют порядка 50 - 70% Т-лимфоцитов.